新型植物疫苗——超敏蛋白原藥（蛋白肥料）制劑“信號施康樂”

    試 驗 名 稱： 

    HarpinEcc過敏蛋白制劑“信號施康樂”防治煙草花葉病毒室內藥效試驗

    試驗委托單位：
    四川海博氏生物科技有限公司

    承 擔 單 位：
    中國科學院成都生物研究所

    試 驗 地 點：
    中國科學院成都生物研究所非載體實驗室

    參 加 人 員：
    林燕燕  邵文艷  陳光耀  張玨

HarpinEcc過敏蛋白制劑“信號施康樂”防治煙草花葉病毒室內藥效試驗

    含3.3% HarpinEcc過敏蛋白制劑“信號施康樂”系四川海博氏生物科技有限公司研制的新型、安全、高效生物誘抗劑產品，為明確其對煙草花葉病毒病的防治效果，我們在標準條件下對其進行防治煙草花葉病毒病的室內毒力測定和相關實驗，報告分三個部分：

    一、誘導煙草過敏反應（HR）；

    二、誘導擬南芥基因表達譜變化；

    三、誘導煙草抗煙草花葉病毒效果。

    相關試驗設計和結果如下：

    試驗地點：

    中國科學院成都生物研究所非載體實驗室溫棚

    試驗設計

    一 、試驗設計內容一 ：誘導煙草過敏反應（HR）

    Harpin是由革蘭氏陰性植物病原細菌“過敏反應與致病性(hypersensitive response and pathogenity，hrp)”基因簇中的某些基因編碼的、性質和功能相似的一類蛋白質，富含甘氨酸、不含胱氨酸、對蛋白質酶敏感、熱穩定，大多在寄主植物上具有毒性功能，能在非寄主植物上引起過敏反應(HR)。過敏性反應(hypersensitive reaction , HR) 是植物基本的抗病反應。這種過敏反應表現為非寄主植物受侵染組織快速、局部的萎縮和壞死，從而限制了病原菌的擴散，進而誘導系統抗性，這是植物抵抗病原侵染的普遍表現形式和有效途徑。

    1 過敏反應測定

    采用注射法測定HarpinEcc蛋白制劑誘導煙草的過敏反應。用毫針穿刺煙草葉片，用注射器注射300mg?mL-1的HarpinEcc蛋白制劑 100mL，重復3次，將煙草植株置200C -250C溫室培養，觀察點樣處葉片反應。設無菌水為空白對照。

    2 HarpinEcc蛋白制劑誘導煙草的過敏反應結果

    分別用HarpinEcc蛋白制劑，無菌水注射于煙草葉片。300mg?mL-1  的HarpinEcc蛋白制劑處理12hr左右引起煙草葉片萎縮、塌陷，24hr該處枯死，產生焦斑，而無菌水對照處理煙草葉片未出現過敏反應。HarpinEcc蛋白制劑以及無菌水處理后24hr的煙草葉片反應結果見圖1： 

    上圖: 煙草照片是右圖照片中煙草的左側處理葉片一部分, 所見焦斑處是經過HarpinEcc蛋白制劑處理24hr左右所形成，其中A、C 點為注射 300 mg?mL-1的HarpinEcc蛋白制劑 100 mL； B、 D 點為注射無菌水100 mL為對照處理。下圖: 是經過處理的整株煙草，其中所見焦斑處是經過HarpinEcc蛋白制劑處理12hr左右所形成；該圖表明Harpin Ecc蛋白制劑能誘導煙草的過敏反應。

    二、試驗設計內容二 誘導擬南芥基因表達譜變化

    

    1  材料和方法

    1.1 實驗材料

    1.1.1  30mg?mL-1的HarpinEcc蛋白制劑

    1.1.2 基因芯片分析實驗用擬南芥為Columbia(Col-0)生態型, 植株蓮座葉片生長到14片, 生長階段為1.14, SD為2.6, CV為10.2, 生長時間25天左右。此供試實驗材料描述根據Douglas C Boyes等公布標準。

    1.1.3  ATH1基因芯片購于Affymetrix公司, 芯片介紹及質量控制標準參見Affymetrix公司ATH1使用說明。

     1.2 基因芯片分析實驗設計

    為檢測HarpinEcc蛋白制劑處理后引起的擬南芥基因表達動態變化, 實驗設為6組, 每組使用一株擬南芥, 第1~5組為實驗組, 分別在噴施HarpinEcc蛋白制劑后第3 h、12 h、24 h、36h和48 h取樣, 第6組為對照組, 不噴施HarpinEcc蛋白制劑。將配制好的30 mg?mL-1的HarpinEcc 溶液3 mL均勻噴施于實驗組擬南芥, 噴施時, 均嚴格與其它參與實驗的植株隔離。每組取擬南芥地上部分, 液氮保存, 送上海生物芯片公司, 完成總RNA提取、芯片雜交以及數據提取等工作。

    2  HarpinEcc蛋白制劑誘導的擬南芥基因表達時程動力學分析  

    通過分析基因芯片在5個實驗組樣本中檢測到的有效基因數(Present gene)和發生顯著表達差異基因數(基因表達量與對照基因表達量相比之log ratio≤?1或≥1), 結果顯示在HarpinEcc蛋白制劑作用后的第3 h、12 h、24 h、36 h以及48 h, 檢測到的有效基因數相近, 發生顯著表達差異基因數分別為912,1787,2393,1833,1755, 發生顯著表達差異基因/有效基因百分數分別為6.9%,14.0%,17.5%,14.0%,13.2%, 參見表1。

    擬南芥發生顯著表達差異基因數隨著HarpinEcc蛋白制劑作用后的時間逐步上升, 到24 h達到最高值, 隨后逐漸緩慢下降, 但相比對照和初始檢測點(3 h)仍然維持較高水平。證明HarpinEcc蛋白制劑作用于植物體后, 誘導的植物整體反應是一個漸進過程,在24 h左右達到峰值，并且HarpinEcc蛋白制劑的作用具有時間上的持續性, 推測這與Harpin誘導植物產生系統獲得性抗性等長效反應相關。

    在所有發生顯著表達差異的基因中, 有208個基因在5個樣本均顯著表達上調, 其中96個基因為未知功能基因, 23個基因功能與植物激素相關, 18個基因與植物抗逆性相關, 20個為轉錄因子蛋白基因, 37個基因功能與光合作用、能量傳遞相關, 其他功能基因為15個。在與植物激素相關基因中, 生長素相關基因12個, 蕓苔素1個, 赤霉素7個, 乙烯2個, 細胞分裂素1個。由此推測HarpinEcc蛋白制劑可能通過誘導生長素、蕓苔素、乙烯、細胞分裂素、赤霉素等信號通路促進植物生長發育, 提高抗逆性。

    在208個持續表達上調的基因中, 有幾個基因值得注意: 植物病程相關蛋白PR-1(At2g14610)和PR-5(At1g18250), PR-1和PR-5是水楊酸依賴途徑誘導植物產生系統獲得性抗性的標志基因, 植物產生抗病性的生化指標, 這兩個基因的持續表達上調證明HarpinEcc蛋白制劑誘導擬南芥產生系統獲得性抗性。另外檢測到3個thaumatin-like蛋白基因(At1g73620、At2g28790、At4g38660)表達顯著上調, 其功能與植物體抵抗真菌和其他病原菌相關。基因At2g27080功能未知, 根據其cDNA序列推測屬于Harpin誘導蛋白家族(Harpin-induced family protein)[18], HarpinEcc蛋白制劑作用后誘導At2g27080持續表達上調初步證實At2g27080的表達與Harpin類蛋白作用相關, 但At2g27080是否確實屬于Harpin誘導蛋白家族基因以及其表達產物功能等, 還有待進一步研究證明。

    將已知和預測的擬南芥1827個轉錄因子分為56個家族。根據每個家族中發生顯著變化的基因數, 篩選與HarpinEcc蛋白制劑作用關系密切轉錄因子家族。分析表明, 在5個實驗組樣本中, 篩選到的轉錄因子家族及其種類既有相同之處又具有差異。整個實驗涉及39個轉錄因子家族中的基因表達發生顯著變化, 3 h組涉及基因表達發生顯著變化的轉錄因子家族21個, 12 h組32個, 24 h組26個, 36 h組25個, 48 h組21個。

表1  樣本有效基因數及顯著表達差異基因數

Table 1  Present genes and regulated genes in the samples

 

    分析表明, 有13個轉錄因子家族在5個實驗組樣本中都篩選到, 它們分別是：ZIM、BES1、TCP、C2C2、AP2/EREBP、WRKY、bHLH、bZIP、GARP、MYB、NAC、HB和C2H2家族, 這些轉錄因子家族主要和以下幾個方面的生物學效應相關: 植物抗性相關, 如AP2/EREBP、C2H2、NAC、MYB、bZIP、WRKY家族; 植物開花相關, 如ZIM、TCP、C2H2、bZIP、C2C2、TCP家族; 植物光合作用、生長相關, 如BES1、TCP、C2C2、C2H2、HB、GARP、bHLH家族。每個樣本中與HarpinEcc蛋白制劑作用相關轉錄因子家族見附表一。

    其它篩選到的轉錄因子家族所調控的基因的功能也主要涉及植物抗性和生長發育, 但是在發生時間和持續性上具有差異。HarpinEcc蛋白制劑處理擬南芥后, 處理不同的時間所誘導發生的生物學效應是有差異的, 同時可能誘導植物體發生某些共同的生物學效應, 這些生物學效應主要涉及誘導植物產生系統獲得性抗性和促進植物生長發育, 與植物體上宏觀可見的HarpinEcc誘導植物抗病原菌、抗逆境和促進生長發育等生物學效應是一致的。

    三、試驗設計內容三  誘導煙草抗煙草花葉病毒效果

    

    1  藥劑

    1.1試驗藥劑及處理劑量
   

    試驗用含3.3% HarpinEcc過敏蛋白制劑“信號施康樂”，分別配制成含HarpinEcc蛋白10mg?mL-1、20mg?mL-1、30mg?mL-1和40mg?mL-1幾種濃度。

    1.2對照試劑及病毒處理劑量

    對照試劑：清水對照

    TMV病毒處理劑量：125mg/L

    2 試驗材料與方法

    2.1材料

    2.1.1供試毒源  煙草花葉病毒（TMV）粗提液（濃度為125mg/L），由中國農科院微生物菌種室提供，由本實驗室保存。

    2.1.2 供試植物  普通煙草

    2.1.3 供試藥劑  HarpinEcc 蛋白制劑

    2.2 方法

    2.2.1  HarpinEcc蛋白制劑的誘導抗性處理

    配制HarpinEcc蛋白制劑的系列濃度為10、20、30、40mg?mL-1，以清水為空白對照。選取生長一致的四、五葉期煙草幼苗，做以下處理：將配制的各濃度HarpinEcc溶液，均勻噴至葉片上至不流失為度，強化誘導三次。在第7天分別人工摩擦接種125mg/L濃度 的TMV 溶液于煙草第三、四的葉片上，置于250C條件下培養，各個處理均以3 株為一個重復組，重復3 次。

    2.2.2 病情調查

    2.2.2.1病情調查方法及分級標準

    根據中華人民共和國煙草行業標準——煙草病害分級及調查方法，調查記載總葉數，病葉數，病情嚴重度，計算病葉率，病情指數和防效。
病害嚴重度分級標準0級：全株無??；

    1級：心葉脈明或輕微花葉，或上部三分之一葉片花葉但不變形，植株無明顯矮化；

    2級：三分之一至二分之一葉片花葉，或少數葉片變形，或主脈變黑，植株矮化為正常株高的三分之二以上；

    3級：二分之一至三分之二葉片花葉、或變形或主側脈壞死，或植株矮化為正常株高的三分之二至二分之一；

    4級：全株葉片花葉，嚴重變形或壞死，病株矮化為正常植株高度的二分之一以上至三分之一。

    調查方法 ：以株為單位分級調查。

    2.2.2.2 結果計算公式

    3  結果與分析

    HarpinEcc蛋白制劑誘導煙草抗TMV效果見附表。不同濃度HarpinEcc蛋白制劑處理均能誘導煙草對TMV的抗性。由調查結果（附表二）可知，各處理濃度均能達到一定的相對防治效果，且效果很明顯。F檢測結果發現，所有處理與空白對照相比，各處理濃度的病情指數均在0.01和0.05水平上明顯低于對照，差異極顯著，其中當HarpinEcc的濃度為30 mg?mL-1時，相對防效最高，可達65.84%。由附表三可知，用30mg?mL-1 HarpinEcc處理10 d后，誘導抗性表現出來，相對防效可達到66.27%，由調查結果可知，經30 mg?mL-1 HarpinEcc處理后不同天數內相對防效一直可以保持在60%以上水平，由此可知，HarpinEcc對TMV的誘導抗性持效期可超過30 d。

    4 藥效評價

    從本試驗結果可以看出，含3.3% HarpinEcc過敏蛋白制劑“信號施康樂”對生長期人工接種的煙草花葉病毒（TMV）有很好的的防治效果，該蛋白對植物病原不具有直接的抑制或毒殺效果,而是通過誘導植物產生系統獲得性抗性和促進生長發育來提高植物防御病原菌的危害，無毒性，不破壞生物多樣性，無殘留，無公害，環境相容性好，長期或多次誘導不會使植物病原菌產生抗藥性、是農業安全生產技術體系中一種新型環保生物蛋白，因而必將成為一代新型、安全、穩定、高效的植物生長調節劑和生物農藥，值得大力開發和推廣的。

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不僅專注作物高產，更重要的是從根本上增強植物免疫能力

 

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